Definición

La electroforesis de ácidos nucleicos es el método habitual para separar, identificar y purificar moléculas o fragmentos de DNA y RNA. En los tampones habitualmente utilizados, los ácidos nucleicos están cargados negativamente y migran hacia el ánodo. Cada molécula aporta una carga negativa (procedente del grupo fosfato), por lo que la relación carga/tamaño es prácticamente constante e idéntica para todas las moléculas, independientemente de su tamaño (un nucleótido tendrá la misma movilidad que un fragmento de doble cadena de 800pb o uno de 5kb).


La electroforesis de DNA se lleva a cabo en geles de agarosa o poliacrilamida. Ambos soportes son restrictivos para los ácidos nucleicos, de modo que los diferentes fragmentos (al tener la misma relación carga/tamaño), migran en función de su tamaño y/o conformación (tabla II).
• Los geles de poliacrilamida (en cubetas verticales) se emplean para fragmentos pequeños de DNA (5-500pb), así como para la mayoría de los RNA.
• Los geles de agarosa (en cubetas horizontales) se utilizan para fragmentos grandes de DNA (500pb-10Mb); utilizando agarosas de distintas concentraciones (distinto grado de reticulación) pueden separarse fragmentos de hasta 50kb aplicando un campo eléctrico constante; para separar fragmentos de tamaño superiores a 50kb se utiliza la electroforesis de campo pulsante en la que la dirección del campo eléctrico cambia periódicamente.

 

Electroforesis en geles de agarosa.


Se trata del método más común para el análisis, purificación y obtención de DNA. Las agarosas disponibles comercialmente presentan una amplia gama de grados de pureza y especificaciones. La presencia de polisacáridos sulfatados, contaminantes en algunas agarosas, puede ser perjudicial, ya que son inhibidores de las enzimas con las que va a tratarse el DNA purificado en la electroforesis (polimerasas, ligasas, endonucleasas de restricción, etc.).


Un aspecto importante de las agarosas es su estado físico. La agarosa estándar gelifica a 35°C y funde a 80-90°C, aunque las hay modificadas por adición de grupos hidroxietilo, que gelifican a menos de 30°C y funden a 65°C. Estos datos son importantes, ya que finalizada la electroforesis, el gel se puede licuar a temperatura superior a la de fusión y así separar el DNA en disolución.

También es importante tener en cuenta la fragilidad del gel. Su resistencia mecánica se expresa en gr/cm2, que representa el peso que puede soportar 1 cm2 de un gel de agarosa al 1%. La agarosa estándar tiene una resistencia de 1000-2000gr/cm2, las de bajo punto de fusión alrededor de 200gr/cm2 y las de alta resistencia llegan hasta 6000gr/cm2.
Hay agarosas de gran reticulado para fragmentos de pequeño tamaño molecular; utilizadas a concentraciones de 2.0-4.5% (y mantenidas a 4°C) separan eficazmente fragmentos de DNA de 700-3000pb. Además, algunas son transparentes lo que facilita enormemente el proceso de detección.

 

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