INTRODUCCIÓN


Microscopio Láser Confocal

El funcionamiento del microscopio láser confocal es muy similar al del microscopio de epifluorescencia. Su principal ventaja es que permite obtener imágenes de mayor calidad mediante técnicas de filtrado espacial que eliminan la luz que proviene de planos fuera de foco. Esto permite controlar la profundidad de campo y, además, obtener series de imágenes del espécimen cambiando el plano de foco. Se pueden obtener secciones ópticas de 0.5 a 1.5 micras de especimenes fluorescentes de un espesor de aproximadamente 50 micras o más.

Microscopoio Confocal
Figura 6 - Microscopio confocal

Fue inventado a mediado de 1950 por Marvin Lee Minsky con el objetivo de visualizar las redes neuronales y observar los eventos biológicos en sistemas vivos. Debido a problemas en la intensidad de las fuentes de luz y a la escasez de potencia de cálculo de las computadoras de la época, el invento pasó desapercibido por mucho tiempo. El primer instrumento comercial apareció en 1987, y se desarrolló durante los años '90 debido al avance en óptica y en electrónica.

En este tipo de microscopio la fuente de luz es un láser que ilumina el preparado a diferentes alturas, generando secciones ópticas. Uno de sus componentes fundamentales es el pinhole, que filtra la luz proveniente de planos fuera de foco.

El pinhole es una apertura localizada delante del fotomultiplicador que evita el pasaje de fluorescencia de las regiones de la muestra que no están en foco, la luz que proviene de regiones localizadas por encima o por debajo del plano focal no converge en el pinhole y no es detectada por el fotomultiplicador.

Con relación al microscopio de epifluorescencia, una ventaja de la utilización de un láser es que su intensidad puede ser regulada, reduciendo así la pérdida de fluorescencia por "fluorescence fading", que consiste en la pérdida de fluorescencia del fluoruro por fotooxidación.

Esquema Confocal
Figura 7 - Esquema de funcionamiento

En la figura 7 se observa un esquema de funcionamiento de un microscopio láser confocal. El haz de láser pasa a través de un pinhole situado en el plano conjugado (confocal) con el punto de observación en la muestra. En frente al detector hay otro pinhole confocal con el plano de foco.

El láser emitido se refleja en un espejo dicroico y escanea la muestra en el plano de foco, provocando la fluorescencia del fluorocromo, que emite fotones en el mismo plano focal. Estos fotones atraviesan el espejo dicroico y llegan al fotodetector luego de atravesar el pinhole del detector. Las emisiones de fluorescencia que ocurren en puntos por encima y por debajo del plano de foco, no son confocales con el pinhole del detector y por lo tanto son bloqueados por éste. Al igual que en el microscopio de epifluorescencia, la luz ingresa a un fotomultiplicador que la convierte en una señal eléctrica.

Para formar la imagen del plano de foco Z el láser escanea la superficie del preparado en el plano X-Y, luego se selecciona otro plano de foco y escanea nuevamente, obteniendo así una serie de cortes de la muestra. La obtención de secciones ópticas más o menos gruesas está determinada por una combinación entre el diámetro del diafragma de detección, la apertura numérica del objetivo y la longitud de onda de la luz utilizada.

Modulo confocal
Figura 8 - Módulo confocal

En la práctica, el microscopio láser confocal es un módulo que se anexa al microscopio de epifluorescencia. En la figura 8 aparece un esquema de un módulo confocal. Este módulo dispone de varias entradas que permiten excitar la muestra con láseres de distintas longitudes de onda, de acuerdo al fluoróforo que se utiliza. En general consta de 3 canales que pueden ser excitados de forma simultánea o secuencial, es decir que se enciende un láser por vez, se adquiere la imagen, se apaga el láser y se enciende el siguiente. Para escanear la superficie en el plano X-Y se utilizan dos espejos "Galvano Scanning Mirrors". La luz emitida por la muestra pasa por el espejo dicromático y luego es separada por canales, donde cada fotorreceptor recibe un canal.

Comparacion
Figura 9 - Imágenes epifluorescencia (arriba) y confocal (abajo)

En la figura 9 aparece una comparación de imágenes obtenidas con microscopio de epifluorescencia (a) (c) (e) y las mismas muestras utilizando microscopio confocal (b) (d) (f) respectivamente. Se aprecia claramente cómo se elimina la fluorescencia que está fuera del plano de foco.




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